点评 | 张礼和（中科院院士、北京大学医学部）、蒋华良（中科院院士、中科院上海药物研究所）、郭子建（中科院院士、南京大学化学化工学院）、邵峰（中科院院士、北京生命科学研究所）

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在复杂的生命体系中原位研究蛋白质功能具有重要的科学意义，但目前适用此类研究的技术十分有限。与基于抑制剂的“功能缺失型”调控方法相比，蛋白质原位激活的“功能获得型”方法具有更高的灵敏度和时间分辨率，因而在活体环境内开展蛋白质动态功能研究方面具有很大的优势，受到了研究者的广泛关注。但对于绝大多数蛋白质来说，目前还缺乏这类原位激活的技术手段。

2019年5月8日，北京大学化学与分子工程学院陈鹏课题组与王初课题组合作发展了一种在活体细胞或动物内瞬时激活蛋白质的普适性新技术,相关成果以Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems为题在Nature杂志上发表。

在这一工作中，作者们发展了一种基于可遗传编码非天然氨基酸的“邻近脱笼”策略（computationally aided and genetically encoded proximal decaging, CAGE-prox），结合计算机辅助设计与筛选，在一系列不同种类的蛋白质上实现了高时间分辨的原位激活，为在活体环境下研究蛋白质动态功能变化提供了一种通用和便捷的化学生物学技术。利用CAGE-prox,他们在活细胞或活体动物内建立了“激酶正交激活和信号转导系统”、 实现了“具有时间分辨率的凋亡蛋白酶特异激活和底物鉴定”，发展了“基于金属蛋白酶激活的抗肿瘤蛋白前药”。这些应用展示了CAGE-prox在活体环境内开展蛋白质动态功能研究与调控的普适性。Nature杂志还在同期邀请专家对该工作进行了评述。

“化学脱笼”策略是一类适用性广、干扰度低的蛋白质激活方法，通过对酶的关键催化残基的保护和脱保护，可以实现对其活性的“关－开”调控。在这一研究思路的指导下，陈鹏课题组先后在赖氨酸、酪氨酸等活性氨基酸侧链上实现了生物正交断键反应和脱笼，在活细胞及活体动物内实现了蛋白激酶等多种蛋白质的特异激活。然而，受限于可以进行脱笼反应的非天然氨基酸类型，上述基于催化残基的“直接脱笼“策略只能在某些特定蛋白家族中应用。如何进一步发展广泛适用于不同类型蛋白家族的原位激活方法，在活体环境内研究蛋白质动态功能变化，是众多化学生物学研究者力图实现的重要目标。

除蛋白质活性位点的氨基酸外，催化中心附近的其它残基通过稳定蛋白结构、提供底物结合口袋等途径对蛋白质活性产生影响，那么在这些邻近位点上进行保护和脱保护反应，是否同样可以实现对蛋白质活性的选择性调控呢？基于这一假设，陈鹏课题组与王初课题组展开合作，将计算机辅助设计与可遗传编码的非天然氨基酸技术有机结合，探究并发展了一种普适性的“邻近脱笼”策略，通过对活性中心邻近残基位点的原位脱笼，在活体内实现对不同类型蛋白质的特异性激活（下图）。

在该“邻近脱笼”策略中，通过向蛋白质活性中心附近的特定位点引入一种带有保护基团的非天然氨基酸（脱笼氨基酸）, 可实现对其酶活功能的干扰和抑制；随后通过“脱笼”反应将保护基团移除，使酶活得以恢复（上图）。首先，由于针对不同的蛋白质所使用的是同一种脱笼氨基酸，所需要改变的仅仅是引入位点，因此该方法具有较高的普适性。其次，该方法无需知道目标蛋白的具体催化机理，只要在活性口袋附近插入脱笼氨基酸影响其底物结合，即可达到激活效果，适用范围广。最后，由于“邻近脱笼”仅仅在活性口袋附近的某个位点引入了一个氨基酸的突变，与其它复杂的蛋白质工程方法（例如融合光敏感或小分子敏感结构域）相比，激活的几乎是一个接近野生型的蛋白，可以更加真实地模拟生理条件下蛋白质活性恢复。

经过对蛋白质活性口袋内大量氨基酸残基的分析以及模拟突变后对蛋白质结构的影响，作者锁定了带有光保护基团的邻硝基苄基-酪氨酸（ONBY）在“邻近脱笼”策略中加以应用。该脱笼氨基酸可以通过遗传编码的方式引入目标蛋白质的特定位点，在紫外光照射后发生光脱笼反应，重新产生天然的酪氨酸。

在确定使用ONBY作为一种普适性的蛋白质脱笼氨基酸后，下一个亟需解决的问题是如何在目标蛋白中快速而又准确地找到合适的引入位点？基于“邻近脱笼”策略的假设，需要保证ONBY的插入可以通过阻断底物结合抑制蛋白质的活性，而在经过光脱笼反应后生成的酪氨酸突变又不会对蛋白质的活性产生影响，从而达到原位激活蛋白质的目的。为了实现对ONBY插入位点的高效选择，同时避免大规模饱和突变筛选的繁琐流程，作者借助计算机辅助的蛋白质结构设计进行虚拟筛选，然后再对计算机预测的插入位点进行实验验证，这一步骤极大地提升了CAGE-prox方法的的成功率和实用性。

至此，作者建立了在活体内利用CAGE-prox方法激活蛋白质的完整流程（上图）：首先，根据目标蛋白的三维结构，通过生物大分子结构模拟和设计软件Rosetta计算在每一个位点插入脱笼氨基酸（ONBY）对蛋白质稳定性和底物结合能力的影响，然后对几何参数和能量参数都符合筛选条件的 “邻近位点”进行实验验证，最后通过在这些位点插入ONBY，测试是否可以实现对目标蛋白可控激活的目的。

作者们通过CAGE-prox的标准操作流程,分别在荧光素酶、GTP水解酶原癌蛋白KRAS、RNA去甲基化酶FTO、蛋白激酶MEK1、细胞凋亡蛋白酶caspase-3和金属蛋白酶炭疽杆菌致死因子（lethal factor，LF）等一系列蛋白质上展示了该方法的普适性（下图A）。其中，针对活性位点未知的纳米荧光素酶（nano luciferase），作者利用分子对接技术模拟了小分子底物与蛋白质结合的复合物结构，并在此基础上进一步预测了邻近脱笼激活位点，最终实现了对其的光控激活。FTO、KRAS和LF是活性中心分别结合铁、镁和锌离子的金属结合蛋白，其功能直接依赖于这些特定的金属离子。利用CAGE-prox,作者在这些蛋白质上也预测发现了邻近脱笼位点，通过遗传编码插入ONBY实现了这些金属蛋白的选择性激活，充分展示了CAGE-prox在体激活不同类型蛋白质的广泛适用性。

利用CAGE-prox, 作者们发展了一种正交的激酶激活系统，在实现邻近脱笼激活的基础上，通过引入的酪氨酸突变，产生对野生型激酶抑制剂的抗性。基于该方法，他们在利用抑制剂对细胞内固有激酶进行特异性抑制的同时，实现了对外源引入激酶的正交光控激活。该策略在未来能够帮助研究人员在排除内源酶活性干扰的情况下，对目标激酶和相关信号转导通路进行特异研究与靶向干预（上图B）。

Caspase是在细胞命运调控中发挥关键作用的一类水解酶，此前对其水解底物的鉴定大多在体外进行，而利用小分子诱导细胞死亡所鉴定到的底物蛋白则是很多蛋白酶被同时激活后的混合产物。利用CAGE-prox,作者们发展了一种具有时间分辨率的蛋白质组学技术，实现了在活细胞内对caspase直接底物的鉴定。他们首先通过计算在caspase-3结构中预测发现了一个合适的邻近位点，插入ONBY后可以特异性激活该蛋白酶，并在1小时内即可诱导细胞产生凋亡表型。他们进而在这一时间尺度下利用定量蛋白质组学技术对caspase-3瞬时激活后的酶切底物进行了全面分析，发现了239个全新的底物蛋白，极大地拓展了对细胞凋亡初期过程的认识（上图C）。

最后，作者利用CAGE-prox构建了一种基于“蛋白质前药”（protein prodrug）的肿瘤杀伤策略。此前已有研究通过对小分子前体药物的靶向释放，拓宽了癌症等疾病的治疗窗口，显著增加了药物的治疗效力,但相关工作尚未在蛋白质等生物大分子上开展。作者因此利用CAGE-prox在小鼠体内对炭疽致死毒素蛋白（LF）进行了可控激活，将其发展为基于蛋白质的前体药物。在利用保护性抗原蛋白（PA）将LF有效地递送进入细胞胞质后，通过光控激活LF的毒性实现对癌细胞的选择性杀伤。由于结合了紫外光的区域选择性，这一多重靶向系统可以确保LF选择性地杀死肿瘤细胞，对正常细胞无害，显著地提升了其作为前药的治疗窗口（上图D）。

综上所述，陈鹏课题组和王初课题组合作发展的CAGE-prox技术，可以广泛地应用于不同类型蛋白质的在体、瞬时激活。这一普适性的化学生物学前沿技术，为今后深入开展蛋白质动态修饰和化学干预研究提供了有力的工具，在从基础生物学研究到蛋白质药物研发等一系列领域都具有广阔的应用前景。

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评述链接：

（1）张礼和（中科院院士、北京大学医学部）：

化学生物学对生命科学中的重大科学问题的研究已经逐渐从静态向动态、从定性向定量、从体外向体内深入发展。生物正交反应可在活细胞等生理条件下高效进行原位的化学反应，是化学生物学家为生命科学研究开发的重要工具。例如，基于生物正交反应的化学标记探针，已经实现在活体环境下对核酸、蛋白质、糖等生物大分子进行特异成像与示踪。近年来，在利用生物正交反应对蛋白质的表达、定位进行原位标记和观察基础之上，科学家们还希望能够直接对其功能进行动态研究甚至操控，从而进一步揭示蛋白质机器在复杂生命过程中扮演的角色。相比于传统的利用小分子抑制剂研究蛋白质功能的方式，通过功能获得型（gain-of-function）的策略研究蛋白质的工作机制将更加有效。陈鹏课题组此前率先利用基于生物正交断键反应的化学脱笼策略，结合遗传密码子拓展技术，实现了在蛋白质催化位点的生物正交脱笼，进而原位激活其功能。在最新的工作中，他课题组与北大同事王初课题组合作，进一步提出并发展了“邻近脱笼”的新策略，利用计算机辅助设计与筛选，将蛋白质脱笼技术的适用范围从催化位点拓展至整个活性口袋，获得了具有广泛适用性的蛋白质激活新方法。该工作是化学生物学领域的一项重要进展，为在活细胞及活体动物内开展蛋白质动态功能研究提供了关键技术，也为生物正交反应开拓了新的前沿方向。

（2）蒋华良（中科院院士、中科院上海药物研究所）

“生物大分子的动态修饰和化学干预”是化学生物学的前沿研究领域，生物正交反应是这一领域的关键技术之一。对蛋白质活性的原位调控方法具有较高的灵敏度和时间分辨率，有助于在活细胞和活体动物水平上开展蛋白质动态功能研究；发展普适性的蛋白质原位激活技术意义更加重大，是近年来化学生物学家一直在关注和探索的前沿热点。

几年前，北京大学陈鹏课题组发展了“化学脱笼”生物正交反应方法【1,2】，可通过对蛋白质关键残基的化学保护和脱保护反应，实现对其活性的正交调控。利用这一技术，他们先后在赖氨酸【1,2】、酪氨酸【3】等天然氨基酸侧链上实现了生物正交断键反应和化学脱笼，并开展了磷酸激酶等蛋白质家族的特异激活和机制研究，是国际上较早发展和应用“化学脱笼”技术的课题组之一【1-6】。最近陈鹏课题组和王初课题组合作，发展了一种基于邻近脱笼策略的蛋白质原位激活新方法。该方法巧妙地将侧链保护的非天然氨基酸定点引入到蛋白质的活性中心附近，可实现对目标蛋白质的活性抑制，再通过脱笼反应将蛋白质激活。实施这一策略的关键步骤是精确确定插入非天然氨基酸的特定位点，需要既能保证脱笼前蛋白质活性的抑制，又能实现脱笼后蛋白质的激活。“穷举”的实验办法费时费力，而通过经验观察结构进行挑选则不具有普适性。因此，他们应用了计算机辅助结构设计和虚拟筛选的策略，通过归纳和学习荧光素酶的实验数据，建立了一个筛选邻近激活位点的计算模型，再通过分析邻近位点与活性中心之间的距离、角度以及非天然氨基酸脱笼前后对蛋白质稳定性的影响等多种因素，决定下一步是否对该位点进行实验验证。这种基于蛋白质结构计算的辅助筛选方法，可以准确地将大量无效的邻近位点快速排除，提高实验尝试的精准度。值得一提的是，他们还利用计算机分子对接技术尝试构建了另外一种荧光素酶与底物结合的复合物结构，并在此基础上进行了邻近激活位点的筛选，实现了对活性中心未知蛋白质的选择性激活，预示如进一步改进，他们的方法可以对蛋白质激活位点进行预测。

近年来，随着生物大分子结构模拟、设计、分子对接和药物筛选等方法和技术的愈发成熟，计算化学和计算生物学在生物医学研究的各个领域逐渐崭露头角。该工作可谓是一个计算机辅助分子设计与化学生物学研究有机结合的经典范例。鉴于深度学习方法和技术在过去几年里发展迅速，可以预见，随着未来蛋白结构与功能研究实验数据的积累，该研究所采用的计算策略将有可能不断地通过自主机器学习和迭代更新来实现更强大的智能化分析。从“排除无效位点”到“预测有效位点”，从相关性分析到因果性归纳，以及从人为的设定到通过机器学习自动选择参数。期待这样“计算化学生物学”的研究成果和范例不断涌现，积极推动化学生物学与计算化学、计算生物学和人工智能的进一步交叉融合，促进生物医学和药物研究。

参考文献

[1] Li, J.; Yu, J.; Zhao, J.; Wang, J.; Zheng, S.; Lin, S.; Chen, L.; Yang, M.; Jia, S.; Zhang, X.; Chen, P. R. Nat. Chem. 2014, 6, 352-361.

[2] Li, J.; Jia, S.; Chen, P. R. Nat. Chem. Biol. 2014, 10, 1003-1005.

[3] Wang, J.; Zheng, S.; Liu, Y.; Zhang, Z.; Lin, Z.; Li, J.; Zhang, G.; Wang, X.; Li, J.; Chen, P. R. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 15118-15121.

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[5] Luo, J.; Liu, Q.; Morihiro, K.; Deiters, A. Nat. Chem. 2016, 8, 1027-1034.

[6] Pawlak, J. B.; Gential, G. P. P.; Ruckwardt, T. J.; Bremmers, J. S.; Meeuwenoord, N. J.; Ossendorp, F. A.; Overkleeft, H. S.; Filippov, D. V.; van Kasteren, S. I. Angew. Chem. In. Ed. 2015, 54, 5628-5631.

（3）郭子建（中科院院士、南京大学化学化工学院）

金属蛋白是生命体内一类非常重要的蛋白质，在广泛的生理活动中发挥关键作用。据估计，蛋白组内接近一半的蛋白质均为金属蛋白，它们通常通过半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的侧链基团与一个或多个金属结合，执行结构或催化功能。因此，通过对单一的金属结合位点的保护和“脱笼”策略实现金属蛋白的选择性激活面临着巨大的挑战。

本工作所发展的邻近脱笼策略，成功地突破了这一限制，在展示的7个例子中，GTPase、FTO和Lethal Factor均是金属蛋白，充分显示出了这一方法在激活金属蛋白的适用性，具有重要的科学意义。尤其是对金属蛋白酶Lethal Factor在活体动物内的激活，系统探究了细菌毒素蛋白作为抗肿瘤蛋白质前药的可能性，具有临床开发潜力。该技术在推动活体环境下金属蛋白功能方面的研究非常值得期待。

（4）邵峰（中科院院士、北京生命科学研究所）

Caspases家族蛋白在细胞程序性死亡等生命活动过程中扮演着重要的角色，caspases家族成员的功能以及不同成员间的相互作用关系往往错综复杂，因此如果能够以高选择性和高时间分辨率地方式激活某一特定家族成员，就可能为caspase蛋白的表型-功能-机理的研究提供有力的工具。文中建立的“邻近脱笼” 化学生物学方法，实现了在特定时间点对细胞中caspase-3的选择性激活，进而发现caspase-3在激活后的30左右分钟即可导致细胞发生凋亡的表型, 在该时间尺度下，利用有时间分辨率的定量蛋白质组学实验实现了对caspase-3直接底物和早期底物的鉴定，该方法有效避免了二次修饰和其他通路激活对鉴定caspase-3底物的影响。值得注意的是，文中建立的“邻近脱笼”方法不仅适用于所有的caspase家族成员，还可拓展到其他蛋白质水解酶，为由各类不同水解酶产生的细胞生理、病理过程的研究提供了新的化学生物学工具。

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